自动化培养去除黑点问题有同路老师吗

黑点问题：该项问题作为水试剂生产商常会遇到的问题，大部分老师会放弃细胞，换新细胞。该问题国外很少，国内实验室多是一个因素，试剂人员技术等迁就因素汇总，我司十几年统计，目的是要建自己的系，所以需更深入了解关键因素，结合难养系（这类一超长时间培养，维持培养）这类问题就频发，换成种子库级别试剂，结合实战，问题可顺利解决（国内实验室用到种子库级别成本较高，建议正规库来源细胞做技术储备，我司可对接这类细胞，问题痛点准确并重复一致），结合自动化培养方面研发，该类问题可通过成像识别与算法结合，自动化可区分，细胞膜厚度，形态，消化快慢等，区分出不同组，分别培养，就能养出差别组，成像识别与计算机算法我们不懂，目前只能涉及到这步了，现在描述简单，真验证需要资金，时间等，都是可观的难题与痛点。我们从手动加案例已能排除该类问题，如您公司研发涉及到该点，可深入讨论可行性。举例目的是前面提到的各种问题都是这个思路，因该方向属于基础中的基础，同路较少，也只能说到这里了。其他对应的问题都适合参考。

预判：一两年后自动化培养躲不开我列的这几个问题：黑点，生长慢，不成瘤细胞优化，污染去除，变形修复，转染死细胞过多（相关试剂开发，递送产品开发）冻存复苏死细胞过多（相关试剂开发，技术储备）这几项也是自建系，耐药株等高级实验会遇到的痛点。有相关技术讨论可来信，这几项都可开发自动化培养-冗余试剂-技术储备（关键点，团聚，成片，堆叠，sv40,上皮，含血清，无血清，酶裂解，促锚着，单细胞，冻存复苏）
转化拓展应用：最终开发相关技术产品后，系统跑出纯国内技术含量，细胞系，为科研，蛋白生产，蛋白药应用拿出可行方案，我们只做水试剂生产，冗余试剂配套。整套黑点去除自动化培养方案，包含上述开发产品所有难点痛点。无用之用。

20260602

HEPES-ATCC-文献
统计与应用目的：难养系空泡伴随影响后续实验组，细胞优化并种子库备份体系，自动化培养冗余试剂组开发，给国内建系组提供一组试剂与完备的技术储备。
采用合成的缓冲剂如Hepes，Tris，Tricine 等。Shipman (1)报告说Hepes缓冲液的浓度高达25mmol/L时，对猴和狗的原代细胞培养物、二倍体人成纤维细胞或9种从人、猴、鼠、仓鼠和兔建立的细胞系均无明显毒性。细胞的增殖、风疹病毒的繁殖以及显微镜下的形态学都作为比较的标准。当使用更高浓度的Hepes(0.lmol/L)时，在所研究的细胞系中有5株产生了空泡现象。Eagle (2)在含NaHCO3、非必需氨基酸以及牛和胎牛血清混合物(各5%)的基本培养基中，使用16种系列的合成缓冲剂，定量测定其酸产量和细胞产量，对正常的二倍体细胞和转化细胞系都作了比较。他注意到在6~7d的培养期间，当这些化合物的使用浓度在10~20mmol/L时没有显著的毒性。Massie等观察到二倍体的人成纤维细胞系WI-38在用Hepes或TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)缓冲的Eagle基础培基中可不断扩大地传代培养。Paul(4)描述了一种新的缓冲系统，它可用于许多细胞系，甚至细胞克隆。这种缓冲系统就是在一标准培基(如NCTC109)中结合使用Tris-柠檬酸盐缓冲系和Hanks盐碱基、草酰乙酸和延胡索酸。对于某些细胞系可能需要有一个适应期(5~10代)。Poole等(3)的研究表明，合成的缓冲系也许并不适合所有类型的细胞，可能特别不适用于分化的细胞。当鸡胚软骨细胞培养在用 Hepes(5mmol/L)、TES(10mmol/L)或BES(10mmol/L)缓冲的 Dulbecco 改良 Eagle培基中时，细胞总是出现胞质空泡。它们的粗糙型内质网和高尔基复合本都胀大，这表明细胞膜的转运或分泌系统由于缓冲物的加人而受到了不良作用。所以作者建议，使用该两性离子缓冲物时要小心。当然，慎重的做法是在加人合成缓冲剂前，传代培养这些细胞系用以进行专门的实验，即比较它们在加入和不加人欲使用的缓冲剂时细胞形态及其功能的差异。碳酸氢盐/CO2和磷酸盐天然缓冲系统可作为标准对照。
1. Dilworth, S., R.J. Hay and P.-M. Daggett. Procedures in use at the ATCC for detection of protozoan contaminants in cultured cells. TCA Manual 5:1107-1110, 1979
2. Eagle, H. Buffer combinations for mammalian cell culture Science(Washington DC)174:500-503,1971
3. Poole, C.A., H.C. Reilly and M.H. Flint. The adverse effects of HEPES, TES, and BES zwitterion buffers on the ultrastructure of cul-tured chick embryo epiphyseal chondrocytes. In Vitro 18:755-765,1982
4. Buick, R.N., T.H. Stanisic, S.E. Fry, S.E. Salmon, J.M. Trent and P.Krasovich. Development of an agar-methyl cellulose clonogenic assayfor cells in transitional cell carcinoma of the human bladder. Cancer Res. 39:5051-5056, 1979.
细工配套培养基验证、种子库备份、上游工艺优化种子库，国内建系组推荐并沟通上下涉及所有痛点难点。特殊培养，耐药株，耐酸碱株驯化建系保种，自动化培养、转染，冻存复苏，简易单克隆筛选等精准SOP撰写合作。
无hepes保种（难养系保种与扩增目的）-长期种子库评价与国产试剂备份体系，验证难养系空泡伴随影响细胞质量，胰酶相关膜损伤评价对比，上述问题组对比组验证，相关文献与实战案例统计。陆续推出统计结果，HEPES敏感系，与原代建系方法统计。凋亡研发涉及相关内容，种子库在优化等。
实战应用：转染后死细胞过多问题-转染前细胞提升质量，耐药株前细胞质量优化，凋亡组在优化种子对比组，特殊培养驯化保种等目的，国内培养体系备份组，难重复经典文献在优化组，合作实验室共享国内库来源细胞（为验证准确性，一致性）